sgRNA设计方法及靶基因细胞敲除的应用

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基于CRISPR经典的基因敲除系统包含sgRNA序列和Cas蛋白，sgRNA序列长度一般为20个核苷酸。常用于DNA双链切割活性的Cas蛋白包括Cas9和Cas12。由于不同Cas蛋白识别的PAM序列，切割效率及特异性不同，本文将以Cas9蛋白为例详细介绍sgRNA的设计，质粒构建及细胞敲除过程。 1.sgRNA设计 1.1 基于基因名称的 sgRNA 设计 可通过将基因的名称提交给在线软件完成，目前常用的仅通过输入基因名称就可完成sgRNA设计的在线工具有CHOPCHOP(https://chopchop.cbu.uib.no/)[1]，CRISPick(https://portals.broadinstitute.org/gppx/crispick/public)[2-4], 和TKOv3(https://crispr.ccbr.utoronto.ca/crisprdb/public/library/TKOv3/)[5,6]。下面我将以CHOPCHOP软件为例简要介绍其sgRNA设计的具体流程。 （1）首先登录CHOPCHOP软件，在Target菜单输入基因名称如TBK1,之后选择合适的物种如‘Homo sapiens’，所用Cas蛋白选择‘CRISPR/Cas9’,sgRNA设计目的 ………………………………