手把手教学｜shRNA设计步骤及注意事项

主要观点总结

本文介绍了短发夹RNA（shRNA）的原理、设计步骤和注意事项。shRNA能够调控基因表达，通过RNA干扰机制降解目标mRNA。设计shRNA序列需要避免连续出现四个及以上的T碱基，可选择G碱基开头以获得最佳表达效果。文章还介绍了如何设计PLKO.1-puro-FTO-shRNA质粒图谱，包括选择所需物种、找到靶标序列、设计shRNA序列等步骤。

关键观点总结

关键观点1: shRNA的原理

shRNA是一种具有环状结构的分子，能够在细胞内转录和产生与目标mRNA特定区域互补的siRNA。这些siRNA通过RNA干扰机制介导靶向mRNA的降解，从而调控基因表达。

关键观点2: shRNA的设计步骤

设计shRNA序列包括选择目标基因、找到靶标序列、设计sense序列和antisense序列、确保序列两端包含特定的酶切位点等步骤。设计PLKO.1-puro-FTO-shRNA质粒图谱需要知道AgeI与EcoRI的酶切位点，并将shRNA序列插入到PLKO.1载体中。

关键观点3: 注意事项

在设计shRNA时需要注意避免连续出现四个及以上的T碱基，可选择G碱基开头以获得最佳表达效果。另外，可以多设计几条shRNA序列，提高基因沉默的效率。

文章预览

1、shRNA的原理 短发夹RNA（shRNA）是一种具有环状结构的分子，其设计合成的序列能够在细胞内转录和产生与目标mRNA特定区域互补的siRNA。这些siRNA与目标mRNA结合，通过RNA干扰（RNAi）机制介导靶向mRNA的降解，从而调控基因表达。 其作用原理基于RNA干扰（RNA interference, RNAi）机制。首先，设计和合成具有特定序列的shRNA。一旦引入到细胞内，shRNA被细胞的RNA干扰机制识别并与RNA诱导沉默复合物（RISC）结合。随后，RISC将shRNA引导到目标mRNA上，并与其互补配对。这一过程会导致目标mRNA的降解或转录抑制，从而阻断目标基因的表达。通过这种方式，shRNA可以有选择性地沉默特定基因的表达，从而实现基因功能研究和潜在的治疗应用。 如何设计shRNA序列并将其构建在载体上呢？ 一般会在PLKO.1-puro载体的U6启动子区域之后将shRNA序列插入，而pLK-puro空载体上用于连 ………………………………