手把手教学｜Western Blot全流程实验步骤及常见问题详解

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一、原理 蛋白质免疫印迹法即Western Blot。 它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，基本原理是经过 PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体例如硝酸纤维素薄膜（NC膜）或PVDF膜上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。 以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。 二、流程图： (一)蛋白上清液提取： a、准备工作：分装需要体积的蛋白裂解液（IP/RIPA），再分别加蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：PMSF 体积比为100:1），磷酸化蛋白酶抑制剂（蛋白裂解液：磷酸化蛋白酶抑制剂体积比为100:2）于蛋白裂解液中，加入Aprot ………………………………