手把手教学｜无缝克隆技术的介绍和经验分享

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概念及原理 无缝克隆可将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点，不需要任何限制性内切酶和连接酶，重组效率高。将载体进行线性化，在插入片段正/反向PCR引物5’端引入线性化载体的末端序列，使得PCR产物5’和3’最末端分别带有和线性化载体两末端一致的序列（15 - 20 bp）。这种PCR产物和线性化载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，37℃反应30 min即可进行转化，完成定向克隆。 过程图 线性化载体的制备 选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且载体克隆位点上下游20 bp区域内GC含量在40% - 60%之间的位点进行克隆。 线性化的方法有酶切制备和反向PCR扩增制备。 （1）酶切制备 酶切制备线性化载体时，推荐使用双酶切方法使载体线性化完全，降低转化背景（假 阳性克隆）；若使用单酶切线性化，请适当延长酶切时 ………………………………