手把手教学｜全蛋白的提取方法和注意事项

主要观点总结

文章介绍了两种全蛋白提取方法，包括细胞准备、清洗、裂解液配制、细胞裂解、超声破碎、离心、蛋白变性及存放等步骤，并提供了常见问题解析。文章还强调了蛋白保存的温度和注意事项。

关键观点总结

关键观点1: 蛋白提取在WB实验中的重要性及避免蛋白分解的方法

蛋白提取是WB实验成功的关键，如何避免蛋白分解是关键，包括保持低温、充分裂解、避免频繁温度波动等。

关键观点2: 两种全蛋白提取方法的步骤

包括细胞准备、清洗、裂解液配制、细胞裂解、超声破碎、离心、蛋白变性及存放等详细步骤。

关键观点3: 常见问题解析

包括蛋白降解、保存温度选择、避免胰酶消化细胞等注意事项，以及不同保存温度的优缺点。

文章预览

蛋白提取是WB实验的前期工作，也是WB实验成功的关键。如何避免蛋白分解，有效地提取蛋白显得尤其重要。以下介绍两种全蛋白提取方法以及相关的注意事项： 方法1 1、细胞准备：准备近乎长满的细胞，此处以10cm大皿为例； 2、清洗：用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次，并弃去PBS； 3、收集细胞：加入1mL PBS，用细胞刮刀刮取细胞，慢慢旋转刮取，来回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中，常温1200rpm，离心5min，并弃去PBS； 4、裂解液配制：按照RIPA裂解液（强）：PMSF=100：1，加入400μL RIPA/皿和4μL PMSF/皿，若为磷酸化蛋白，则需加入磷酸酶抑制剂，比例为RIPA裂解液（强）：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1，并置于4℃； 5、裂解细胞：将上述配制好的裂解液加入步骤3 中EP管，4℃裂解15min； 6、超声破碎：将上述裂解后的细胞用细胞超声破碎仪破碎1-2min，功率为2 ………………………………