看文献做实验系列之--介绍一种替换质粒表达gRNA策略

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gRNA的稳健表达对于成功实施CRISPR-Cas9基因组编辑方法至关重要。gRNA组分，例如RNA聚合酶启动子，随后是gRNA编码序列和RNA聚合酶终止子序列，以及Cas9蛋白通过一体化质粒或单独的专用质粒表达。此类质粒的制备涉及费力且多日的DNA组装过程，细菌克隆、验证、纯化和测序。 近期，Roman Teo Oliynyk等人发表的一篇名为《Circular Vectors as an efficient, fully synthetic, cell-free approach for preparing small circular DNA as a plasmid substitute for guide RNA expression in CRISPR–Cas9 genome editing》的文献针对这一问题进行了优化，旨在开发一种高效、全合成且无细胞制备的小型环状DNA，以克服质粒的局限性。 1. 流程概述 该技术为一锅法、全合成、无细胞的环化与纯化方案（图1）。所有反应在单一PCR管或离心管中完成，随后通过离心柱纯化。以下是核心步骤的简要说明： 图1. CV准备步骤概述 ………………………………