手把手教学｜双荧光素酶报告基因实验

主要观点总结

文章介绍了双荧光素酶报告基因实验的原理、步骤和应用。该实验主要用于LncRNA-miRNA、miRNA-mRNA靶向验证及启动子转录活性调控研究。实验通过将目的片段构建在荧光素酶基因后，通过检测荧光值进行分析。文章详细描述了实验步骤，包括质粒构建、细胞培养、质粒转染、模拟物转染、双报告基因检测等。

关键观点总结

关键观点1: 双荧光素酶报告基因实验的原理及应用

实验主要应用于LncRNA-miRNA、miRNA-mRNA靶向验证及启动子转录活性调控研究。原理是含有萤火虫和海参荧光素酶基因的质粒构建后，通过检测荧光值进行分析。

关键观点2: 双荧光素酶报告基因实验的步骤

实验步骤包括构建荧光素酶报告质粒、细胞培养、质粒转染、模拟物转染和双报告基因检测等。需要注意转染试剂的选择和用量，以及裂解细胞的正确方法。

关键观点3: 实验注意事项

实验过程中需要注意细胞铺板密度的控制、转染试剂的参考选择、试剂的配制和保存、样品处理及荧光检测的正确操作等。

文章预览

实验原理： 双荧光素酶报告基因实验通常应用于LncRNA-miRNA；miRNA-mRNA靶向验证验证及启动子转录活性调控等方向研究。 其原理主要是含有萤火虫荧光素酶的基因和海参荧光素酶的基因包含在一个质粒（pmirGLO Vector、Psicheck-2）上，通过质粒构建将我们包含结合位点的目的片段（野生型（WT）、突变型 （Mut））构建在萤火虫荧光素酶的基因或海参荧光素酶的基因的后面，而通过双荧光素酶试剂盒中荧光素和腔肠素分别氧化两种酶并产生生物荧光 ，最后用酶标仪进行检测荧光值。转染miRNA的模拟物或者过表达载体后，与野生型片段结合，降低前者荧光素酶活性，后者即为内参对转染效率以及细胞铺板数量进行标准化。 实验步骤： 接下来以验证miRNA的靶向基因为例，介绍双荧光素酶报告基因实验的步骤： 1、构建荧光素酶报告质粒（WT/Mut） 传统酶切方法： ………………………………