科研干货|质粒构建详细protocol（同源重组法）

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一、质粒构建（同源重组法）      ①载体线性化: 这一步可以通过酶切或者反向PCR来实现，从而得到线性化的载体。 ②插入片段获得: 需要将线性化载体末端的15-20bp序列作为同源序列进行标记，一般使用红色和蓝色来进行区分。这些同源序列会被添加到基因特异性正/反向扩增引物序列的5'端。通过引物对扩增，就可以得到带有同源序列的插入片段。 ③重组反应: 将线性化载体和插入片段按照一定的比例混合，然后在Exnase II的催化下，在37℃下反应30分钟来完成重组反应。这个过程实现了两条线性DNA在体外的重组。 ④转化感受态细胞: 将重组产物直接进行转化，这样在平板上就会形成数百个单克隆，为后续的阳性筛选提供了物质基础。 ⑤流程图 二、线性化载体制备      载体的线性化方式有3种:双酶切→单酶切 → 反向PCR → 推荐双酶切 线性化载体 ………………………………