耐高温T7 RNA 聚合酶仅凭一步IVT反应高效合成circRNA

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在基于 T4 噬菌体胸苷酸合成酶基因或者鱼腥藻 pre-tRNA 的 I 型内含子 PIE 环化策略 中，exoGTP (外源添加) 中游离-3'OH 率先攻击位于 E1-5' Intron halfs 之间的 5'自剪接位点，使得 E1 末端核苷酸 （U） 暴露出-3'OH，进而攻击位于 3'' Intron halfs （ωG） -E2 之间的 3'自剪接位点，发生两次连续的转酯反应，E2/E1 末端核苷酸共价连接，形成封闭环状结构。 所谓 一步法 共环化 ， 指的是在体外转录反应体系中，由于存在 GTP 和 Mg2+ ，因此，从线性化模板转录形成的 precusor RNA 会紧接着发生环化反应，从而使得 IVT 反应产物中存在一定比例的 circRNA。 多数情况下，在 IVT 反应结束后，我们会选择再进行一轮额外的环化反应。重新环化的反应体系和条件为：在收集纯化的 IVT 产物中添加 2mM GTP 与 10mM Mg2+；55℃，加热 8min。这样做的目的是让残留在 IVT 产物中的 precusor RNA 能 ………………………………