手把手教学｜One step cloning实验步骤及注意事项

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One Step Cloning是一种快速构建质粒的方法，也被称为 无缝克隆 或 单步克隆法 。 其原理是基于重组原理的无缝克隆技术，作为新一代的克隆方法，不依赖繁琐的酶切、连接步骤，也不需要末端补平等操作，依据DNA片段与线性化载体末端的15~25 nt同源序列的重组，可将插入片段克隆至任意线性载体的任意位点，载体自连背景极低，是一种简单、快速、高效的DNA定向克隆技术。 One Step Cloning常使用商用试剂盒（如Gibson Assembly Kit或者CloneEZ Kit），试剂盒通常包含三种酶： 5'外切酶 ：这种酶从DNA片段的5'端开始降解，产生突出端的单链DNA，这些单链可以与其他片段的同源序列互补配对； DNA聚合酶 ：这种酶延伸3'末端，通过利用互补的DNA片段作为模板，填补缺失的核苷酸； DNA连接酶 ：在聚合酶延伸完成后，连接酶封闭片段之间的磷酸二酯键，确保DNA片段连接 ………………………………