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手把手教学|CRISPR-Cas9系统:sgRNA的设计及质粒构建

实验老司机  · 公众号  ·  · 2024-10-25 07:00
    

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CRISPR-Cas9系统基本工作原理涵盖了一系列分子事件,从CRISPR序列适应外源DNA片段,通过转录和加工生成成熟的CRISPR RNA(crRNA)或合成单导RNA(sgRNA),到sgRNA与Cas9蛋白的复合形成。 该复合物通过sgRNA的spacer序列导引Cas9蛋白高度特异性地结合至目标DNA,触发Cas9的内切酶活性,引发目标DNA的双链断裂。 细胞察觉到断裂后,启动修复机制,包括非同源末端连接和同源重组,以实现基因组的精准编辑,为疾病治疗和基因研究提供了创新性工具。 一、sgRNA的设计原则 1、特异性:确保sgRNA是特异性的,以免在基因组中发生非特异性的编辑。避免选择与其他基因序列相似的区域,特别是避免在基因组中存在多个拷贝的区域。 2、GC含量均衡:sgRNA的GC含量应该在40-60%之间,以确保在实验条件下有适当的稳定性和杂交性。 3、避免多个剪切位点:选择只有一个目标剪 ………………………………

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