手把手教学｜全蛋白的提取方法和注意事项

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蛋白提取是WB实验的前期工作，也是WB实验成功的关键。如何避免蛋白分解，有效地提取蛋白显得尤其重要。以下介绍两种全蛋白提取方法以及相关的注意事项： 方法1 1、细胞准备：准备近乎长满的细胞，此处以10cm大皿为例； 2、清洗：用预冷的PBS清洗大皿中细胞1-2次，并弃去PBS； 3、收集细胞：加入1mL PBS，用细胞刮刀刮取细胞，慢慢旋转刮取，来回刮2-3次，不留空白，并移至EP管中，常温1200rpm，离心5min，并弃去PBS； 4、裂解液配制：按照RIPA裂解液（强）：PMSF=100：1，加入400μL RIPA/皿和4μL PMSF/皿，若为磷酸化蛋白，则需加入磷酸酶抑制剂，比例为RIPA裂解液（强）：PMSF：磷酸酶抑制剂=100：1：1，并置于4℃； 5、裂解细胞：将上述配制好的裂解液加入步骤3 中EP管，4℃裂解15min； 6、超声破碎：将上述裂解后的细胞用细胞超声破碎仪破碎1-2min，功率为2 ………………………………